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      方案2: 载脂蛋白的等电聚焦

      试剂:

      (1). 将30g丙烯酰胺、0.8g双丙烯酰胺和36g尿素溶于水, 配成100ml溶液。

      (2). 将1mlTEMED和36g 尿素溶于水, 配成100ml溶液。

       步骤:

      (1). 在7ml丙烯酰胺溶液中加1.2ml Ampholine液, 1.7ml TEMED液, 16ml 8M尿素液和40mg过硫化胺。

      (2). 混合后注入两块14x12cm大小(间隔1.5mm厚)玻璃板之间。

      (3). 插入样品梳, 让凝胶聚合。

      (4). 拔出梳子; 加入样品, 中间由一层1ml80%蔗糖, 0.5ml Ampholinet 8.5ml水组成的混合液,将样品与上层缓冲液隔开。

      (5). 将玻璃板装入SE 600平板凝胶系统中(美国Hoefer公司), 在上槽中加0.02M NaOH, 下槽中加0.01M H3PO4。

      (6). 在８℃下以250V电压电泳过夜, 开始能量为3W/板, 次日上午加大电压到800V持续1小时。

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      三、二维电泳

      二维电泳的样本需先按等电聚焦节介绍的方法处理(见方案2)。聚焦后的各凝胶带分别切割并放入pH8.5含0.002M盐酸─甲基吗啉、0.2%SDS、0.1%β巯基乙醇溴酚兰及4%蔗糖的混合液中, 于室温下浸泡15分钟, 然后置于SDS凝胶中再次电泳。此时按Neville的方法进行SDS-PAGE。在下部凝胶中加入丁烷, 凝胶聚合后, 其表面用水冲洗除去丁烷, 然后加入一层下部凝胶缓冲液。在4℃下贮存12小时。最后将上部凝胶溶液(5%丙烯酰胺)混合后注入下层凝胶之下, 使其厚度为1.5cm。将等电聚焦的区带及分子量标准带加入后, 装上电泳仪进行电泳(按方案1)。