| (4). 将400ml去脂蛋白血清与400ml PBS、225g NaCl、160ml脂肪乳剂(已制备的)混合, 用KOH调至pH7.4, 在37℃下振摇水浴孵育。
(5). 用SW28转子在4℃下以27000r.p.m离心20分钟将脂肪乳剂再分离, 然后用10ml PBS使上清液悬浮, 最后用50mM Tris-HCl(pH8.2)进行透析处理。
(6). 将透析过的溶液用小号针头直接注入1000ml乙醇/乙醚(3:1)混合液中进行脱脂处理。在-20℃下孵育24小时, 然后将沉块离心并使其再悬浮。
(7). 重复上述步骤, 分别取800ml孵育24小时, 400ml孵育4小时, 80ml孵育24小时及80ml孵育3小时进行脱脂处理。最后一步脱脂过程是用30ml乙醚孵育2 小时 。以上所有孵育过程都是在-20℃下进行。
(8). 将脱脂处理的沉块溶于7.2M尿素和10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中。用N2使残存的乙醚蒸发。再离心一些不能溶解的物质, 其上层液就可用阴离子交换层析进一步纯化。
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快速蛋白液相层析分析(FPLC)系统结合Mono Q HR16/10层析柱可使Apo AIV与其他脂肪乳剂结合蛋白分离。这个系统由二个P-500梯度泵和一个形成梯度的GP/-250梯度程控器组成。洗脱过程由紫外线监测仪在280nm波长处及记录紫外线吸收的图形描记仪进行监控。所有层析分析过程均在室温下进行。分析柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)和7.2M尿素以1ml/分流速进行平衡处理, 并使用含Apo AIV的液体。然后用150ml 0-300mM NaCl线性梯度液以1 ml/分流速进行洗脱。洗出成份立即进行透析以清除尿素。最后用15%SDS-PADE及Western印迹法进行分析。此种层析分析洗脱出3个主峰值: 第一峰主要含Apo AI, 第二峰含纯Apo AIV, 第三峰主要含白蛋白。 |
