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三、Apo E的分离
采用制备性SDS-PAGE从VLDL中分离出Apo E。
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方案9: Apo E的定量分离
(1). 按LDL分离的方法用超速离心将VLDL从血浆中分离出来。
(2). 用乙醇/乙醚(1:1)在-20℃下脱脂处理12小时, 从中提取VLDL中载脂蛋白。
(3). 用不连续缓冲系统进行制备性PAGE, 其中丙烯酰胺凝胶浓度为15%。在2ml含2%SDS、1%2-巯基乙醇及0.04M Tris-硼酸(pH8.64)的混合液中溶入载脂蛋白50mg, 并在100℃下煮沸3分钟。
(4). 在样本中加甘油, 然后将其加入垂直凝胶柱中。给予恒定电压50V以产生8mA左右的电流。
(5). 用0.02M乙基吗啉/盐酸缓冲液(pH9.2)以4.4ml/小时的流速进行洗脱。在280nm波长下监测液流。收集每份2ml的洗出液。将各份Apo E混合成一管, 这可用SDS-PAGE及免疫印迹法进行监测。
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制备性SDS-PAGE还可在垂直平板凝胶系统中进行。预备1mm厚的5-20%丙烯胺梯度凝胶。将15mg载脂蛋溶于2ml液体中(该液体含0.125M Tris-HCl, pH6.5, 2%SDS, 10%甘油及3%β-巯基乙醇), 按前述方法煮沸。然后将其加于凝胶上。使用恒定电流20mA直至电压达300V。电泳后按制备Apo B48的方法用KCl使蛋白带显示。ApoE带被切除并用蒸馏水从凝胶上洗出。然后用10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.05%SDS透析清除KCl, 最后冻干处理。 | 
