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Apo E也可用SDS凝胶滤过层析法从脱脂的VLDL中提纯出来。这种分离是在室 温下采用2.5x100cm大小的Sephade G-200层析柱(Pharmacia)进行。此层析先用0.01M乙基吗啉/盐酸、0.1%SDS及1mM DTE进行平衡。
四、Apo C的分离
三种Apo C均可用同样技术分离: 即从脱脂VLDL开始, 然后进行凝胶滤过层析分析(去掉较大的Apo E和Apo B), 最后进行阴离子交换层析分析。VLDL及其脱脂的制备按Apo E分离的方法进行。
凝胶滤过层析分析是在1mM烷基硫酸钠中进行, 含Apo C的成份收集后用DEAE(二乙基氨基乙醇)阴离子交换层析柱在8M尿素中进行层析分析。含每类Apo C的成份收集后用PD-10柱进行去盐处理。从DEAE层析分析中收集的Apo CII冻干处理后, 用sepharose G-75分析仪在含0.01M tris-HCl(pH8.6)和5.4 M尿素缓冲液中再进行层析分析。
另外, Apo CII-CIII的提纯还可采用新近介绍的制备性高压液相色谱分析法,将VLDL脱脂后的蛋白成份溶于0.01M Tris-HCl(pH8.2)及6M尿素混合液中, 然后以3000g 离心15分钟以清除不溶性物质(主要为Apo B)。将含有可溶于尿素的VLDL所含载脂蛋白(约3mg)上层清液加于Varian型540高压液相色谱分析仪的反相层析柱上, 此分离过程是在室温下用50mM醋酸氨(pH6.0)作为A溶剂, α-丙烷作B溶剂进行梯度洗脱。洗脱梯度为从100%A溶剂到A、B溶剂各50%, 流速为1ml/分。Apo CII和CIII成分收集后, 用快速真空冻干法进行浓缩, 并按前述的方法再次层析分析。注射前每个样本用0.22um微孔的滤纸(GS型)滤过处理。 |
