(3). 用吸取法或管切法留取上浮物(含LDL)。

      (4). 进一步提纯的方法包括: 制备性SDS-PAGE阴离子交换层析法, 人工脂质乳胶结合及免疫亲合层析法。

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      阴离子交换层析分析前, 超速离心分离出的LDL要用50mM NaCl 和10mM Tris-HCl(pH7.4)混合液进行透析处理。将其加入Hiload 16/10Q Sepharose层析柱上。此柱使用前用同一缓冲液进行平衡处理。其洗脱过程采用FPLC系统, 在室温下用120ml 50-500mM NaCl线性梯度以1ml/分钟流速洗脱。这样分离出的LDL不会混有其他的蛋白类, 这可用银染色PHAST SDS-PAGE法进行监测。

      另外, LDL也可与英脱利匹特(Intralipid)在37℃下孵育29小时。继而以20000g离心30分钟。通过此方法, Apo A及Apo C类可因其脂肪乳胶的高亲合力而被分离。其他蛋白通过免疫亲合层析连续去除, 该层析柱上亲和纯化的多克隆抗体与相应蛋白共价结合。

      (二)、Apo B48的分离

      该载脂蛋白可通过制备乳糜微粒, 脱脂处理及制备性SDS-PAGE法获得。乳糜微粒可从淋巴液中用50.2Ti转子以39000r.p.m在4℃下超速离心18小时获得。收集上层液体, 再悬浮于PBS中, 重复离心(条件同上)。乳糜微粒用乙醇/乙醚(3:1)脱脂, Apo B48通过制备性5%SDS-PAGE法分离。脱脂样本的制备与分析性PAGE要求相同。凝胶和两个槽中的缓冲液都是含有0.1mg/ml的硫酸庆大霉素和偶氮化钠(0.2mg/ml)。为使蛋白带显色, 凝胶置4℃0.2M KCl中孵育过夜。KCl可使凝胶中的SDS沉淀。