| (5). 孵育后, 将Lp(a)制备品置于SW41 Beckman转子中, 以40000r.p.m在20℃下离心3小时。离心之前, 先将3ml初始密度为1.10g/ml的Lp(a)制备品置于3ml密度1.035g/ml及2ml密度1.019g/ml的溶液之下。最后, 大约有4 ml密度1.21g/ml溶液置于管底。
(6). 超速离心后, 回收管底3ml含Apo (a)的溶液。
(7). 最后用0.2mM乙基吗啉(pH8.5)对Apo (a)制备品进行透析处理。并加入抗蛋白水解和抗微生物试剂。
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另外, 第一次超速离心后的含Lp(a)成份还可通过Sepharose 4B柱凝胶过滤层析进一步纯化。5ml含200-250mg蛋白的脂蛋白溶液用洗脱缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH 9.0)透析后上柱(2.5x100cm)收集5ml洗出液, 280mM检测蛋白质, 并通过SDS-PAGE和免疫印迹筛选出Lp(a)。
还有一种方法, 即以抗Apo (a)亲合柱进行免疫亲合层析, 第一次超速离心所获的含Lp(a)部分直接上柱(最好加入到封好的柱上旋转过夜), 以PBS洗涤, 并用含0.2M甘氨酸-HCl(pH2.0)及6M脲和0.15M NaCl的缓冲液洗脱, 洗脱液马上用1M K2HPO4(pH9.8)中和, 并用PBS透析, 最后加入抗蛋白水解酶和抗微生物试剂。
赖氨酸-Sepharose亲合层析是利用Apo (a)与赖氨酸结合的特性(因为其与纤溶酶原同源), 因此也是一种提纯Lp(a)的方法。血浆超速离心后富含Lp(a)的部分用0.1M磷酸盐(pH7.4), 1mM EDTA透析, 然后加到7x2 cm的赖氨酸-Sepharose 4B柱上,此柱用同样缓冲液平衡。洗掉未结合的蛋白质, 结合在柱上的Lp(a)可用含50mM 6-氨基已酸的上述相同缓冲液洗脱。 |
