在4℃下脂蛋白与LDL受体结合, 但脂蛋白受体复合物尚未内在化(internalized),

脂蛋白与LDL受体处于平衡状态,因而可进行平衡结合研究。此项研究的数据可用Scatchard分析来测定脂蛋白与LDL受体的亲合力及每个细胞受体结合脂蛋白的量。所用脂蛋白浓度取决于平衡解离常数(Kd), 应采用大致与Kd数值相等的浓度。以下是常用的放射标记脂蛋白浓度范围: 人类LDL, 0.25-12ug/ml; 人类III型β-极低密度脂蛋白(β-VLDL), 0.2-10ug/ml; 狗Apo E HDLC, 0.01-1.2ug/ml; 狗β-VLDL,0.54-4ug/ml; 及Apo E-双十二酰磷酸胆碱(DMPC)复合物, 0.005-1.0ug/ml。(所有浓度基于Lowry等人的蛋白测定法)

────────────────────────────

    方案4: 用于研究125I-标记脂蛋白与完整细胞表面LDL受体平衡结合的方法

    (1). 实验前, 将带细胞的培养皿置一大盒冰上的金属托盘上预冷10-15分钟。

    (2). 在15ml塑料锥形管内制备并在冰上预冷15分钟后的脂蛋白溶液组成是:DMEM-Hepes-LPDS[N-2羟乙基哌嗪-N'-2磺酸乙烷(Hepes), (代替重碳酸盐)pH7.4缓冲的DMEM, 含10%LPDS]。它含有为双份培养皿准备的6-12种不同浓度的125I-标记脂蛋白。每种浓度的125-I标记脂蛋白的第三块培养皿内的溶液通过加入20-100倍过量非标记配体来测定非特异结合。

    (3). 当细胞培养皿在冰上时, 弃去细胞培养基, 用含放射标记脂蛋白的培养基替代。可采用在16mm皿内加0.25ml, 22mm皿内加0.45ml, 35mm皿内加0.95ml, 60mm皿内加1.9ml。从每管中取两份(每份20ul)测放射活性, 他们用于Scatchard分析法的计算及确定有放射活性脂蛋白的浓度。在冰上孵育并轻摇冷浴中的细胞3-5小时。(4℃下多数脂蛋白的受体结合在5-6小时内达到平衡, 但对多数情况而言, 孵育3-4小时足