125I-标记脂蛋白与培养细胞在37℃一起孵育时, 脂蛋白被受体结合、内在化并在溶酶体内降解。125I-标记载脂蛋白降解为小分子多肽和氨基酸, 混匿于培养基之中。大约在37℃下2小时后达到稳定状态, 结合于受体上及含于细胞内的125I-标记脂蛋白的量固定不变。但随孵育时间延长, 培养基中的降解产物持续增长。可采用较长的孵育时间, 通常用5小时或16小时(过夜)孵育。    37℃下试验与4℃下试验(见方案4)相似,但有以下不同:

    (1). 脂蛋白与LDL受体的外显结合常数在37℃较高,因而应采用较高浓度的脂蛋白。

    (2). 孵育在37℃ 7%CO2培养箱内进行, 所以培养基内不含Hepes,而用含DMEM的NaHCO3缓冲液。

    (3). 脂蛋白与培养基必须避免细菌污染, 尤其是过夜孵育更应注意。使用灭菌的DMEM-LPDS, 并用预冲洗过的带醋酸纤维膜(0.45um用于LDL和HDLc, 0.8um用于VLDL和β-VLDL)的注射过滤器滤过脂蛋白贮存液。

    (4). 在加入细胞之前, 含脂蛋白的培养基应达到或接近37℃。

    (5). 孵育之后, 将细胞置冰上的金属盘中冷却。孵育培养基移出并留作降解分析用(方案7), 洗涤细胞(方案4)。

    (一)、结合脂蛋白的释放

    在37℃下与125I-标记脂蛋白一起进行孵育的细胞含有表面结合与内在化的脂蛋白, 为了区分它们, 在用0.1M NaOH溶解细胞之前, 应使表面结合的脂蛋白从细胞上被释放。