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    方案6: 表面结合与内在化脂蛋白的测定

    (1). 孵育之后, 将细胞冷却(冰上15分钟), 移取孵育培养基作降解测定。         (2). 用冷PBS-BSA迅速洗涤细胞三次,随后进行两次冰上PBS-BSA孵育,各10分钟。

    (3). 加入脂蛋白分离试剂, 冰上冷孵育并轻摇1小时。

    (a). LDL可用4mg/ml硫酸右旋糖酐或10mg/ml的肝素PBS溶液将其从细胞表面受体上释放出来。

    (b). 亲合力比LDL高的脂蛋白, 如含Apo E的脂蛋白, 可用PBS内含30mg/ml的磷酸钠玻璃(六甲基磷酸钠, 9-V030,J,T.Baker或Phosphate Glass, P-8510,Sigma)使之释放。

    (4). 移取一份已知量至12×75mm试管,进行r-计数。

    (5). 吸出剩下的溶液, 用PBS洗涤单层细胞两次。加入0.1M NaOH, 以后按方案4继续进行。

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    (二)、降解分析

    与LDL受体结合后, 125I-标记脂蛋白被内在化并在溶酶体内降解成氨基酸。降解分析法测定释放到组织培养基中的125I-标记酪氨酸。这一分析法的原理是:用三氯醋酸(TCA)沉淀法除去培养基中残留的完整125I-标记脂蛋白, 去除任何游离的125I, 然后测定125I-标记酪氨酸及小分子多肽的放射活性。