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方案7: 脂蛋白降解的测定
(1). 对两套12×75mm和一套13×100mm玻璃试管预先编号。
(2). 在其中一套12×75mm试管中加入PBS-BSA溶液,使其与细胞中的孵育培养基总体积为1ml。细胞置于冰上之后,将培养基移入含PBS-BSA液且已编好号的12×75mm试管中, 洗涤单层细胞, 按方案4进行计数。
(3). 用连续加样器在每支装有1ml培养基PBS-BSA的试管内加入200ul 50%TCA, 涡旋混合, 4℃孵育30分钟。
(4). 在4℃下2000g离心15分钟, 形成TCA沉淀。将1.0ml上层清液移入已编好号的13×100mm试管。用连续加样器在每管中加入10ul 40%KI和40ul 30%H2O2。涡旋混合,室温孵育5-10分钟。
(5). 每管中加入2ml CHCl3, 彻底旋混(上层水相应为淡粉红或淡黄色, 不是深褐色,若呈深棕色, 则需重新旋混)。H2O2将[125I]碘化物转化为[125I]碘, 后者可用氯仿萃取。用100g-200g离心5分钟将水相与氯仿相分开, 吸取625ul上层水相至第二套12×75mm试管内, 塞好, 进行放射活性计数。总降解量=c.p.m×2。 |
